Генетический тест - выбор биоматериала

Автор: Дарья Крылова, Заведующая отделом молекулярно-генетической диагностики лаборатории «ПОИСК», с 2019 года представитель WSAVA в России

Каждый живой организм обладает уникальным набором генов. Этот «генетический отпечаток» может многое рассказать о живом существе, виде, к которому он принадлежит. Например, определение породы, генетика окраса, наследственное заболевание. Сегодня результаты генетических тестов используются все более широко — в ряде областей анализ ДНК постепенно становится вполне обычным инструментом, позволяющим решить множество задач.

Идентификация индивидуума на основе ДНК (Генетическая дактилоскопия, ДНК-дактилоскопия) — сравнительно молодой метод, открытый британским генетиком Алеком Джеффрисом в 1984 году. Первое время «генетический отпечаток» использовался преимущественно в криминалистике в качестве инструмента раскрытия преступлений. Впоследствии генетический тест стали применять в медицине, сельском хозяйстве и ряде других областей — в том числе для установления родства, выявления различных заболеваний, определения совместимости донора и реципиента при пересадке органов, установления личности жертв катастроф. Исследование ДНК лежит в основе огромного числа научных работ, и нас ждет еще много научных открытий в этой сфере.

Для чего нужна генетическая экспертиза животных?

Исследование ДНК животных получило распространение в сельском хозяйстве — для выявления генов, ответственных за желаемые и нежелательные признаки и дальнейшей селекции в соответствии с этим знанием (маркер-зависимая селекция, MAS). Генетические тесты в разведении собак и кошек также набирают популярность и становятся все более распространенной методикой, и востребованной услугой. Вот основные задачи, которые позволяет решить исследование ДНК домашних животных:

• Выявление наследственных заболеваний или постановка диагноза у конкретного животного. В некоторых случаях тест ДНК позволяет быстро поставить диагноз или исключить наследственное заболевание без использования дорогостоящих и требующих введения в наркоз процедур (например, КТ и МРТ).
• Определение генетического статуса чистопородных животных-производителей в питомнике (здоровый, носитель наследственного заболевания, больной). Заводчики прибегают к услуге исследования ДНК, чтобы сократить вероятность появления в новых пометах некоторых наследственных заболеваний (например, первичный вывих хрусталика или летальный акральный дерматит бультерьеров) и снизить частоту мутации в породе.
• Определение частоты встречаемости аллели с мутацией в популяции (в породе). Эта информация позволяет делать прогнозы о развитии породы и помогает улучшить результаты селекционной работы, выявить новые окрасы.
• Ограничение распространения генетических заболеваний с поздним проявлением (например, дегенеративная миелопатия — прогрессирующее поражение спинного мозга, приводящее к потере координации движений конечностей и параличу). Нередко такие заболевания проявляются во взрослом или пожилом возрасте — уже после того, как животное произвело потомство. В этом случае генетический анализ собаки и полученных от нее щенков/котят позволит выявить и вывести из разведения особей с мутациями, приводящими к развитию данного заболевания.
• Подтверждение данных родословной (подтверждение родства, решение спорных вопросов об отцовстве).
• Создание профайла идентификации животного. В России такое применение генетического теста для собак и кошек не распространено, но в ряде стран ведется работа по созданию баз данных ДНК животных для их идентификации, например, в случае их пропажи или установления отцовства.

Выбор биоматериала для проведения исследования

ДНК содержится в любом биоматериале (шерсть, перхоть, слюна и пр.), но в настоящее время для проведения генетического теста для кошек и собак преимущественно используются венозная кровь, буккальный эпителий (эпителий внутренней стороны щеки), иногда — когти, срезанные с захватом ткани кровеносного сосуда.

Рассмотрим два вида биоматериала, которые наиболее часто используются для генетической экспертизы.

Венозная кровь часто используется для проведения генетического теста. Некоторые заводчики предпочитают этот биоматериал, считая анализ на его основе наиболее точным. Действительно, высокая точность результата — один из важных преимуществ крови как материала для исследования. В случае анализа крови исключено загрязнение биоматериала ДНК другой особи (как в случае буккального эпителия). Кроме того, отбор крови для генетического теста не имеет никаких специальных ограничений (изменений диеты, голодания и пр.).

К недостаткам этого биоматериала можно отнести следующие факторы:

• Инвазивность. Некоторые владельцы стремятся избежать взятия крови из вены животного. Агрессивность или высокая чувствительность к стрессу могут быть препятствием для взятия крови. Кроме того, для сдачи анализа требуется визит в ветеринарную клинику.
• Сложность транспортировки. Почтовая пересылка в виде образцов крови из других регионов запрещена законом. Хранение и перевозка требуют определенного температурного режима.
• В случае использования «сухой крови (dry blood spot) стоимость анализа значительно возрастает за счет высокой стоимости реагентов для проведения анализа, что делает использование этого биоматериала для тестирования животных нецелесообразным. Анализ сухой крови используется в судмедэкспертизе, а для конечного потребителя (владельца животного или заводчика) стоимость анализа оказывается неоправданно высокой по сравнению с другими видами биоматериалов.

Кровь из вены для генетического теста отбирается в пробирку с антикоагулянтом (К3ЭДТА), нельзя использовать в качестве антикоагулянта гепарин. Хранится такая пробирка с кровью на дверце холодильника при температуре +4±8 °С, при транспортировке используется хладагент.

Буккальный эпителий (эпителий внутренней стороны щеки) — еще один распространенный вариант биоматериала для анализа ДНК. Его важное преимущество состоит в простоте забора образца: это можно сделать в домашних условиях, и не нужно вести животное в ветеринарную клинику. Впрочем, стоит отметить, что забор образца у чрезмерно нервных или агрессивных животных может вызвать у владельца трудности, как и любые манипуляции с такими животными.

По точности генетический анализ буккального эпителия сравним с точностью анализа крови, хранение и транспортировка образца не требуют специальных условий. Почтовая пересылка этого биоматериала не сопровождается никакими сложностями, что делает его значительно более подходящим по сравнению с венозной кровью в случае проведения анализа в другом городе.

Основным недостатком буккального эпителия в качестве биоматериала для генетического теста является возможность его загрязнения — попадания в образец биоматериала от других особей. С этим связаны некоторые ограничения и требования к забору пробы:

• За несколько часов до взятия у кошки или собаки эпителия на анализ необходимо исключить их контакт с другими животными (а также убрать чужие игрушки и миски), чтобы избежать попадания в пробу посторонних слюны и других биоматериалов
• За два часа до взятия пробы необходимо исключить кормление животного — это обязательное требование! Нередко к нам в лабораторию поступают загрязненные образцы буккального эпителия именно из-за нарушения этого условия.
• В случае щенков до отъема велика вероятность загрязнения образца материнским молоком и слюной однопометников — ведь щенки постоянно едят — и получения недостоверного результата генетического теста. Следует дождаться отъема или, если это не желательно, то использовать для анализа венозную кровь.

Взятие образца буккального эпителия не требует специальных навыков и знаний. Для забора анализа используется цитощетка (предоставляется лабораторией). Необходимо поместить цитощетку между десной и внутренней стороной щеки животного и, удерживая пасть животного прикрытой, двигать щетку вперед-назад, одновременно прокручивая ее и избегая тычков конца щетки в мягкие ткани ротовой полости животного. Процедуру следует проводить в течение 20–30 секунд (примерно 20–30 движений цитощеткой вперед-назад). Для ориентира — прикладывайте такое же давление, как при чистке зубов. Важно регулировать усилие, чтобы, не травмируя слизистую оболочку, собрать достаточное количество эпителия (чрезмерная «нежность» тут неуместна).

Затем нужно повторить манипуляцию с другой стороны пасти, используя вторую цитощетку. Закончив, положите цитощетки с биоматериалом обратно в упаковку и поместите в обычный почтовый конверт вместе с направлением на исследование. Запечатанный конверт доставьте в лабораторию (или отправьте заказным письмом).

Важно: если вы берете анализ у двух или более животных, обязательно мойте руки перед каждым забором образца, чтобы избежать загрязнения биоматериала.

Цитощетки с буккальным эпителием должны быть герметично закрыты, упаковки подписаны. В остальном же до отправки образца в лабораторию не нужно соблюдать никаких особенных условий хранения — буккальный эпителий можно хранить практически бессрочно при комнатной температуре.

Выводы

Стоимость и сроки проведения генетического теста не зависят от вида предоставленного материала. Например, в нашей лаборатории анализ делается 7–10 дней, стоимость варьируется от 1300 рублей¹ как в случае крови, так и в случае буккального эпителия (для заводчиков существует система скидок). По точности результатов эти два вида биоматериала также практически равноценны.

По моему опыту, чаще всего оптимальным материалом для проведения генетической экспертизы животных является буккальный эпителий — благодаря простоте его получения и транспортировки по сравнению с образцами крови. Исключение составляют случаи, когда невозможно обеспечить двухчасовое голодание (например, новорожденные щенки), или когда анализ нужно взять срочно и есть возможность взять кровь из вены (в условиях клиники). Словом, выбор биоматериала зависит от особенностей животного и от условий взятия и транспортировки образцов.

¹По данным независимой ветеринарной лаборатории «Поиск» (Санкт-Петербург) на июнь 2019 г.